组织细胞内抗原的固定

组织细胞内抗原的固定是免疫酶标和非标记免疫酶组织化学方法中的重要环节。经过固定，可以达到如下目的：1.标本在玻片上的吸着力增加；2.标本所含的类脂和蜡质等成分可以除去，从而有利于抗原与酶标记抗体的结合；3.标本的保存时间可以增长，组织切片固定后，在－20℃，可以存放一年以上而不改变免疫酶技术的染色；组织内有关抗原不同，则所用固定剂与固定方法也随之改变。

   丙酮和乙醇是常用的两种固定剂。但对于许多病毒与细菌的定位研究，选择丙酮和四氯化化碳作为固定剂是zui合适的；对于可溶性蛋白抗原的定位，常用乙醇；对于多糖，则用8%－10%福尔马林，而不用乙醇与丙酮等有机溶剂。

   对于那些在表面覆盖蛋白衣膜的抗原，还常用胰蛋白酶、黏蛋白酶、透明质酸酶以及受体破坏酶进行处理。有人报道，苦味酸－甲醛固定液应用于肝组织内甲种胎儿蛋白酶标定位能获得满意结果。

   对于植物病毒材料的固定，丙酮用得zui多，乙醇次之。因为丙酮对病毒的抗原性损害为zui小，但对于那些不稳定的病毒，则应避免固定。

   在应用免疫酶技术时，固定处理对酶的活性的影响也得心中有数。许多固定剂对抗原的活性都 会有所损害，例如，福尔马林对蛋白抗原的固定造成抗原性的破坏非常明显。因此，对福尔马林的使用必须严格控制浓度，一般使用的福尔马林浓度为10%，尽管如此，对抗原的抗原性还是有损害，所以必须进行抗原修复。

   另外，对于碱性磷酸酶，在4℃下，丙酮固定一昼夜，能丧失30%的活性，如用丙酮固定后包埋，则丧失70%的活性；在4℃下，福尔马林固定2－4h，则丧失25%的活性。

   固定条件对标本的固定效果作用较大。

   固定剂浓度：丙酮zui常用的是100%；乙醇zui常用95%，但是70%乙醇的固定力为zui强；福尔马林常用10%。

   固定的温度：一般而言，固定作用随温度升高而加强，室温是zui常用的。固定温度可以－70－30℃。应根据不同的抗原使用不同的温度，麻疹病毒应在－20－40℃用丙酮固定30min，而酶可以37℃用乙醇固定15min.

   固定液的pH：一般以所用固定剂的pH为准，但若以酶去除某些抗原表面的蛋白衣膜时，应根据所用酶的性质调节pH。

   固定时的干湿度：干湿度一般情况下不需考虑，但某些材料在固定时受干湿度影响很大。丙酮对Hela 细胞中的灰质炎病毒固定，在室温干燥的情况下，N抗原就转变为H抗原；而在－20℃不干燥的情况下，N抗原保持不变。

   固定的时间：有长有短，一般在室温下，固定15min左右，低温下固定30min.如仅为了使材料不脱落为了减轻未处理的新鲜冰冻切片出现的空泡，则可用丙酮、乙醇和甲醛作短时间处理。

   固定后的冲洗：固定后的材料常用中性磷酸缓冲液反复冲洗，以免在固定过程中可能弥散出来的物质覆盖表面。

   固定标本的保存：标本材料经固定后，要立即使用于免疫酶技术中，不要久贮。如实在要保存，应置于冰箱（4℃）中，在干燥的情况下24h内抗原性损失不大。在－20℃下，冰冻切片或涂片可保存1周到1个月，石蜡切片可保存数月以上。在－20℃下保存时，为了防止形成过多的冰结晶并发生组织细胞的变化，应将切片浸入聚乙烯醇甘油溶液中，让其在－20℃下形成固态保护膜，然后在免疫酶染色前用手指加温，用生理盐水轻轻洗去，每次5min,共洗3次。这样保存的标本，污染增多。某些干燥标本（例如组织内阿米巴抗原、组织自身抗原）贮于辛烷中可长期保存（－30℃），并且几乎无污染。

   固定的程序很简单，将固定剂用吸管加到标本上去，或将标本置于玻片架上浸入固定剂溶液中，固定后立即用磷酸缓冲液冲洗，然后在空气中晾干或风扇吹干。