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SILAC代谢标记定量实验服务
实验技术简介: SIL AC的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸,细胞经5-6个倍增周期后,稳定同位素标记的氨基酸*掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合,经分离、纯化后进行质谱鉴定,根据一级质谱图中两个同位 素型肽段的面积比较进行相对定量。属于体内代谢标记法。
实验操作流程:
1、蛋白提取和样品制备
2、标记效率测试
3、样品混台
4、SDS-PAGE分级
5、酶解
6、质谱鉴定
7、软件分析
8、定性定量蛋白质组结果
9、生物信息学数据挖掘和统计分析
实验注意事项:
客户提供:
1、蛋白质提取物: 浓度>1μg/ul, 蛋白质总量>300μg.
2、细胞:通过细胞计数取不少于2x106个细胞于EP管,加入0 5ml生理盐水或蛋白保护剂,混匀后保存于冰箱(-80°C, 避免反复冻融)。
交付标准:
1、蛋白质鉴定和SIL AC定量分析结果;
2、客户蛋白质对应的质谱峰图;
3、SIL AC实验完整的实验步骤、使用仪器、软件检索参数等。
其他:
1、SILAC是体内标记技术,稳定同位素标记的氨基酸与天然氨基酸化学性质基本相同,所标记的细胞和未标记细胞在生物学行为上几乎没有差异,标记效率可高达100%。
2、采用质谱定量,定量结果准确且批次变异小、重复性好。
3、体内代谢标记与SDS- PAGE或色谱分离技术相结合,兼容疏水性蛋白和偏碱性蛋白,不受蛋白性质限制。
4、多个样品混合后同时进行分离、酶切和鉴定,后续实验对样品的影响一致, 减少了实验操作和仪器设备产生的影响。
5、由于该技术属于体内标记,标记效果稳定,其标记效率不受裂解液的影响,不仅适合于进行全细胞蛋白的分析,还适合于膜蛋白的鉴定和定量。
6、与化学标记相比,SIL AC方法蛋白需要量明显减少,通常每个样品只需要几十微克的蛋白量。
7、活体标记,更接近样品真实状态。
8、只适用于活体培养的细胞,对于生物医学研究中常用的组织样品,体液样品等无法分析,对于动物模型的标记成本太大,无法实现。与体外标记技术相比,SIL AC属于体内标记,具有以下技术优势
1、高通量,可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质;
2、定量精确,降低由于样品制备不同而造成的实验差异;
3、线性定量范围广;
4、灵敏度更高,蛋白质需要量明显减少;
5、标记采用的是体内标记技术,更接近样品真实状态。
SILAC技术服务内容
1、细胞同位素标记;
3、SDS-PAGE分离;
4、胰酶酶切后液相分离和质谱分析;
5、数据库检索及蛋白质定量分析;
6、差异蛋白的生物信息学分析;
7、实验报告提交。
实验服务报告内容
1、蛋白定鉴定和SIL AC定量分析结果;
2、顾客蛋白质对应的质谱峰图;
3、SIL AC实验完整的实验步骤、使用仪器、软件检索参数等。
技术服务优势
1、灵敏度高,检测限低,可检测出低丰度蛋白;
2、分离能力强,分析范围广,iITRAQ可以对任何类型的蛋白质进行分离鉴定,包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白,膜蛋白和不溶性蛋白;
3、高通量:同时对8个样本进行分析,提高了实验通量,可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析;
4、结果可靠:定性与定量分析结果更加可靠;
5、自动化程度高:液相与质谱连用,自动化操作,分析速度快,分离效果好。
实验代做服务:
ELISA试剂盒免费代检测 | CCK8检测 | 基因组DNA提取
| 蛋白相互作用分析 |
Western Blot
| 免疫组化 | 荧光定量PCR | 动物模型服务 |
流式细胞检测 | 细胞增殖 | 激光共聚焦 | DNA甲基化实验 |
细胞划痕 | 钙离子浓度检测 | 扫描电镜实验 | microRNA 测序 |
动物实验 | Taqman探针 | ATP/ADP检测
| 石蜡/冰冻切片 |
定点突变 | 线粒体膜电位(MMP)检测 | 细胞生长曲线的测定 | 药理毒理动物实验
|
免疫共沉淀 | 真核表达载体构建 | 染色质免疫沉淀CHIP | 非标定量(Label-free)实验 |