琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒

Midi Purification Kit

保存条件：本试剂盒在室温储存 18 个月不影响使用效果。

产品介绍：

在高离序盐存在的情况下，DNA 片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，漂洗液将引物、核苷酸、蛋白、酶等杂质去除，最后用低盐、高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净 DNA 从硅基质膜上洗脱。

产品特点：

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2. 使用了优质溶胶液，不含传统溶胶液的碘化纳和高氯酸盐，不抑制回收后酶切、连接克隆等下游反应。

3. 溶胶液调制成为了黄颜色，便于观察溶胶效果和监测 pH 值变化从而达到较理想结合效果，大大提高回收效率。

注意事项:

1. 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。使用前应该恢复到室温。

2. 储存于低温（4℃或者-20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃-25℃）进行。

3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

4. 溶胶液中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或者生理盐水冲洗。

5. 回收纯化的DNA片段一般在100bp到40kb之间，过长、过短片段的回收效率降低。

6. 回收DNA的量和起始DNA的量、洗脱体积、DNA片断大小有关。一般1-20μg， 100bp-5kb的DNA片段，回收率可高达85%-95%。

7. 切胶回收时，紫外灯观察对DNA片段有损坏作用，应该尽可能使用能量低的长波紫外线，并且尽可能的缩短紫外线下处理的时间。

8. pH值≤7.5时，吸附膜吸附DNA的效率最高。如果切下来的凝胶中含有电泳缓冲液太多，造成溶胶后溶胶液pH偏高，会导致回收率降低。溶胶后，如果溶胶液依旧保持黄色，说明pH正常；如果变成橘红色或者淡紫色，说明pH偏高，可在胶充分溶解后加5-10μl   3M醋酸钠（pH5.2）将pH值调到5-7（黄色）。

9. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA， 不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱， 但应该确保pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱，DNA片段应该保存在-20℃。DNA片段如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl，1mM EDTA， pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

自备试剂：无水乙醇

操作步骤：

提示：*次使用前请先在漂洗液 WB 中加入量无水乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

1. 在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的 DNA 条带切下，尽量切除不含 DNA 的凝胶，得到凝胶体积越小越好。

2. 将切下的含有 DNA 条带凝胶放入 1.5ml 离心管，称重。

3. 加 3 倍体积溶胶液 DD。（凝胶重为 100mg，则加入 300μl 溶胶液）如果凝胶浓度大于 2％，应加入 6 倍体积溶胶液。

4.56℃水浴放置 10min（或直至胶*溶解）。每 2-3min 涡旋震荡一次加速溶解。

5. 可选,：每 100mg 最初的凝胶重量加入 150μl 的异丙醇，震荡混匀。

6. 将上一步所得溶液加入吸附柱 EC 中（吸附柱放入收集管中），室温放置 1min，12,000rpm 离心 30-60sec，倒掉收集管中的废液。

7. 加入 500μl 漂洗液 WB  （请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm  离心 30sec，弃掉废液。

8. 重复操作步骤 7。

9. 将吸附柱 EC 放回空收集管中，12,000rpm 离心 2min，尽量去除漂洗液，以免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应。

10 取出吸附柱 EC，放入一个干净的离心管中，室温放置数分钟。

11.在吸附膜的中间部位滴加洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置 2min，12,000rpm  离心

1min。如果需要较多量 DNA，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，离心 1min。(注意：洗脱体积不应小于 30μl，体积过少影响回收效率)