酶联斑点（Elispot）实验服务

酶联斑点(Elispot) 技术概述：

酶联斑点(Elispot) 全名为酶联免疫斑点检测，英文: Enzyme-linked Immunospot Assay.它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术(即ELISA技术)， 能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。其技术原理，一句话概括就是:用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。

1、实验的准备工作

(1)设备与耗材:

①超净工作台;

②5% CO2 37°C细胞培养箱;

③P20，P200， P1000 微量移液器,

④P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器,

⑤Biosys ELISPOT Reader

⑥P20，P200， P1000 枪头;

⑦多道移液器吸槽;

⑧0.5mL, 1.5mL EP管。

(2)溶液配制

①PBS:用分析纯试剂，Millipore级别的纯水配制， 高压灭菌。

②PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意无菌操作。储存于20-25°C, 可存放一个月。

③70%乙醇:分析纯乙醇70mL，加入Millipore级别的纯水至100mL。

④30%乙醇:分析纯2醇30mL,加入Millipore级别的纯水至100mL.

⑤包被抗体(coating antibody, Primary antibody): 照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用PBS稀释50倍，每孔50uL。

⑥封闭液:用PBS将试剂盒中的封闭存储液(Blocking stock solution R)稀释10倍，每孔200uL。

⑦抗体稀释液:注意，只是用来稀释检测抗体和酶联亲和素。用PBS将试剂盒中的稀释存储液(Dilutionbuffer R)稀释10倍

⑧检测抗体(Biotinylated detector antibody, Secondary antibody):照U-Cytech说明书， 加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100uL。

⑨酶联亲和素(Streptavidin-HRP conjugate):照U-Cytech说明书，加入双蒸水溶解。使用时，用抗体稀释液稀释100倍，每孔100uL。

D AEC显色液: 照U-Cytech说明书， 用100mL 30%乙醇溶解底物缓冲液胶囊(Substrate bufercapsule),然后加入3.3mL AEC储存液(AEC stock solution),混合均匀后10ml每支分装，-200C保存。

使用时，解冻，每孔加入100pL.

①PHA刺激物:将储存液(2mg/ml，Murex)分装成20μL/EP管， -20*C长期冻存。 使用时，加入980μLU-Cytech无血清培养基(或者1640基本培养基),成为工作液(40μg/mL，10倍终浓度)，每孔加入10μL, 终浓度4μg/mL。

②U-Cytech无血清培养基:我们推荐无血清ELISPOT技术，它能排除血清的干扰，结果更加稳定可靠,背景也更好。如果没有，可以用含10%血清的1640培养基代替。

2、ELISPOT标准操作程序

(1)第—天: ELISPOT包被程序设计好试验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。每孔加入15μL 70%的醇预湿30秒。

注意:

①未润湿的PVDF膜是洁白的、不透明的，经过乙醇润湿之后，颜色变暗，变成半透明状，很容易观察二者的区别。

②加乙醇的时候，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不到刺到PVDF膜。

③有时候，加入的乙醇挂在孔壁上， 这时要盖上板盖，轻轻叩击，让乙醇顺势滑落。乙醇一 旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。

④15μL 是经过优化的体积，它能保证刚好*浸润整块膜，而不会有剩余。如果加大使用量，乙醇溶液就会透过膜而积存在膜的背面,加深实验的背景。

⑤加入100μL去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留。

⑥按照试剂盒的使用说明，将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中，每孔加入50μL，4°C包被过夜。

⑦(次日)倾倒包被液，用PBS洗涤5次，后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。

⑧加入200μL试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C封闭1小时。

⑨倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培养。(也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤- -次, 拍干,封口，4°C保存，可以在4°C保存数周。)

(2)第二天:铺细胞，加入刺激物，培养

①整个实验设置-组正对照(PHA刺激), 每一个细胞样品(同-个捐献者或者实验动物)要设一个负对照

(不加刺激物)，整块板还要加一个背景负对照(不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂)。

②填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设置2-4个孔的重复(想要有统计学的意义，每个细胞/刺激物设4个孔的重复)。

④取出封闭好的板，准备加入细胞。如果是以前做的封闭，可以加入200μL 的U-Cytech无血清培养基,室温静置10分钟，倾倒，然后再重复- -次。

⑤按照实验卡片的安排，加入不同浓度的细胞，100uLwell, 细胞在孔中的分布要尽量均匀(要诀是加入

细胞之后，不要再震动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况刚好相反)。正对照的细胞浓度为1x105/well,实验组的样品细胞浓度请自行调整。

⑥加入100μL的U-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。

⑦正对照孔加入10μL PHA,终浓度4ug/mL,该浓度能有效刺激IFN-V的分泌。

⑧加入实验者自己的刺激物(配制成10X终浓度，10uLwell)到实验孔。 加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀，实际上，通过扩散，刺激物也会很快混合均匀。拍击板子会让细胞成圈的分布在孔的外周。

⑨当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养18-24小时。 注意在整个培养过

程中避免移动、碰撞培养板。为了取得更好的结果，甚至开关培养箱的箱[ ]也应该禁止。因为碰撞会造成细胞的移位，造成斑点的模糊、拖尾。

(3)第三天:培养后操作

①倾倒孔内的细胞及培养基。

②低渗法将细胞裂解，每孔加入200μL冰冷的去离子水，将板置于冰上冰浴10分钟。

③每孔用200μLPBST洗涤10遍，洗涤后- 遍之后,将板倒扣在吸水纸上拍干。

④按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释检测抗体，每孔加入100μL生物素标记的检测抗体,37°C 1小时。

⑤每孔用200μL PBST洗涤5遍，洗涤后一遍时， 将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。

注意:

①洗涤膜的背面，我们摸索出的办法是，在-个浅托盘中盛上干净的PBST,将膜板的底面浸入，轻轻摇晃几次即可。注意，-定要将膜的背面和塑料保护层上的液体甩干之后，再合拢，盖上，不要伤害到膜。

②按照试剂盒说明的浓度，用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素，每孔加入100L, 37°C 1小时。

③每孔用200μL PBST洗涤5遍， 洗涤后-遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。

④照试剂盒的说明，解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温静置20-30分钟，注意避光。

⑤待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上,拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30分钟，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。

⑥将ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自动读板仪内,调节好合适的参数，半点计数,并记录斑点的各种参数，作统计分析。

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